先进的分离和提取工艺发酵产物的作用

 

许多发酵产物,如蛋白质、多肽、酶、核酸等物质往往娇气得很,它们以解状态存在于发酵液,遇热、遇强酸、猶等易于破坏变质,要想提纯它们必须使用更加特殊的方法。于是科学工作者把生化工程中使用的凝胶过滤、超过滤和冷冻干燥技术用到了发酵工业中。虽然这仅仅是个开端,但已经显现出强大的生命力。

凝胶过滤也称为凝胶层析、凝胶分子筛、凝胶渗透层析。凝胶有许多种,如葡聚糖凝胶(国外商品名Sephadex),聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶。目前用较多的是葡聚糖凝胺。它是一种具有多孔性三度空间网状结构的髙分子化合物。

葡聚糖凝胶的颗粒,大小约为50~150微米。将它装在一个玻璃管内形成一个凝胶柱,如果我们把蛋白质和硫酸铵的混合溶液,由柱上方倾入,将会发生什么现象呢?让我们先来看看所加溶液中的两种溶质有些什么特点。蛋白质是由氨基酸组成的,分子量大到几万到十几万,而硫酸铵是由铵离子和硫酸根组,分子量仅132。所以硫酸铵能顺利地进入凝胶粒子的分子网络之中,而蛋白质则被阻于粒子之外,在粒子间穿来穿去,随着溶液向下流动。如果用烧杯在柱下收集流出液,可以发现开始流出的液体含有蛋白质而没有硫酸铵。这样就把两种物质分离开了。在实际应用时,就是利用的上述原理。发酵产生的酶经常用盐溶液分离和纯化,因此得到的酶含有较多的无机盐类,欲除去此盐类,就可用凝胶层析方法去脱盐。

同样在以凝胶分子筛提纯核苷酸时,也是利用分子大小的差异。在磷酸二酯酶降解核酸生成57-核苷酸时,因其中含有未降解的核酸、蛋白质、色素等杂质,而不能制造出合格的注射液。而5′-核苷酸的分子量为400左右,远比那些杂质分子小,所以可以将它们分开。但是在使用凝胶过滤法分离不同的氨基酸时,却并非利用氨基酸分子间的差别,而是借助于芳香族氨基酸对凝胶颗粒具有较弱的吸附作用,碱性氨基酸具有强的吸附能力,酸性氨基酸则被凝胶颗粒部分排斥的原理来分离。

使用凝胶过滤时主要设备是玻璃或有机玻璃制成的分离柱。上下装有滤板,其中充填凝胶颗粒。要求凝胶表面要平整,内部均匀分布。料液加入的动力有两种,如将料液置高位,以产生重力控制流速,使液体慢慢加入柱内,同时应加恒压储液瓶使操作压稳定。实际上这种方法的流速恒定是不够精确的。在需要精确分离时,往往采用恒流泵。蠕动泵就是常用的一种恒流泵。它是利用圆滚子在偏心盘中旋转挤压橡胶管产生压力差来输送料液。洗脱液一般为单一的缓冲液,经过凝胶柱之后流入收集器,可人工操作,亦可自动收集。可根据体积、重量或时间确定收集高峰浓度。

工业生产用的大型凝胶分离装置。分离柱用金属材料内衬涂料或耐腐蚀材料。流量计用以控制流速。

化学实验中用滤纸过滤沉淀,滤纸表面似乎“天衣无缝”,实际上存在着眼晴看不见的孔洞,直径约有10微米以上。大槪谁也不曾听到过孔洞直径为数十至数百埃(1埃=l0-6mm)的“滤纸”吧!这种超级“滤纸”真可谓“分子水平”。它就是在酶提纯中广泛使用的超过滤膜《应用超过滤膜进行物质的分离技术称为超过滤技术。

超过滤膜是醋酸纤维或硝酸纤维制成的膜。制备技术比较复杂,以不同方法和条件可以制得不同大小孔径的膜。膜很薄,大约为0.1~1微米。为了加大机械强度,紧贴膜后面还有一个厚1毫米的海绵层,它具有疏松多孔性质,二者共同组成过滤膜。如果把这种膜用尼龙布包好装在用激光打出孔的管内,就组成了一个管束式超过滤器。经过预处理除去固相颗粒后,澄清的酶液以一定压力和速度进入超滤器,其中酶分子由于比膜的孔径大而被截留,分子量较小的如色素、无机盐与其它杂蛋白很容易地穿过膜从另一口汇集流出。这样就达到了浓缩酶的目的。

板式超过滤装置是用若干矩形过滤板和夹板相互安装在一起组成的敞开型超过滤器。也可将圆形过滤板装入压力容器中形成密闭型超滤器。另外一种更巧妙的方法,是把制膜材料纺成空心丝,再用环氧树脂将它们两端胶合在一起,再装入管壳,此称为中空纤维式超过滤器料液在管内或管外流动进行分离。

利用超过滤方法,可以制备各种酶、梭酸、激素、疫苗、病毒和抗生素。例如有人采用丙烯腈类管状半透膜(膜的孔径不超过6X与管式内流型超滤器二组串连,

管内压力保持34.32?36.28Pa(3.5?3.7公斤力/厘米a),流速3米/秒,通过预处理的碱性蛋白酶液。经一次超过滤后,可使酶浓缩5.2倍酶活力损失不超过5%。如果把此方法与刮板浓缩比较,则显出酶活力损失小、浓缩倍数髙、节约能源、设备简单的优点。

在日常生活中我们都有过这样的经验:寒冷的冬季,瞭在露天的湿衣服冻得象武士的铠甲,但在长时间以后竟也会慢慢变干了。可见在OT℃以下,水结冰之后,也可以直接变为水蒸汽蒸发掉。这种由固态不经液态而直接变为气态的现象,称之为升华现象。此现象还可在萘、碘等化学物质中看到。在冷冻状态下除掉水分的方,在发酵产品的提取中也常常用到,即冷冻干燥技术。它是在-10?-30X)的低温,S.67?40.OPa(0.05?0.3毫米汞柱)压力的髙真空下,将物料或溶液中的水分直接升华的一种干燥方法。常用于高度热敏性物质(如酶)和无菌物料(如抗菌素)的干燥和微生物菌种的保藏。

在采用冷冻干燥方法时,应先将小瓶或平盘中的料液在千燥箱中(-40?-501)进行预冻,冻结后,再开动真空泵使干燥箱内的压力降至6.67~40.0Pa(0.05?0.3毫米汞柱),此时冻结料液中的水分迅速升华,约有95%的水分在这种状.态下除去。与此同时还利用通过电热丝或流动于蛇形管中的

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水或油以増加一定的热量,使最终水分去除掉。这种操作类似于一般的真空干燥。为了使升华出来的水汽,不致迸入真空泵,在干燥箱与泵之间装有冷凝器,使来自干燥箱的水汽重新冻结为霜。在抗菌素冷冻干燥时,一般在-40°℃左右冻2?5小时,而水分升华则在-30?-50°℃,压力为4?8Pa(0.03?0,06毫米汞柱)情况下进行,最终加热温度至15?40X5,依不同品种而异。总干燥时间18?30小时。

冷冻干燥后制成的产品,质地疏松,水溶性很好。但这种方法的设备较贵,操作维修费用较大,又因分批操作,生产能力有限,所以应用不甚普遍。

发酵产品的分离与提取工艺是发酵工程中的重要组成部分之一。随着科学技术的发展,生化工程中的技术越来越多地应用于发酵工程。并显市出更加精细和商效的优点,使产品的得率提髙,质量益精。由于发酵产品的多样化,发酵原料结构的改变,又不断地给分离和提取工艺提出崭新的课题。因此必须在微生物发酵高产的情况下,通过科学的分离与提取取得良好的效果。



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