先进的分离和提取工艺是微生物工程的重点之一

 

通过分析测定,在确认发酵过程终了时,及时地将发酵:罐中的发酵液由出料口放出,储存在容器内。如何从发酵液中取得我们所需要的物质,是发酵工业中的一个重要课题。发酵液存在大量的微生物菌体、残佘的固形物料和液体内溶解状态的各种物质。真是鱼龙混杂,难以分辨。目前借鉴化工手段和生化工程技术,能巧妙地从庞杂的混合物中,去其糟粕取其精华,“百里挑一”地得到我们所需的物质。

假如发酵产物溶解在发酵液中,那么首先要从中除掉所有菌体和残料。用板框式压滤机和普通离心机即可达到这一目的。前者是用泉把发酵液压入压滤机,其内滤布挡固形物的前进,液体透过滤布流出;后者是利用离心机转鼓髙速旋转产生的离心力,将固体甩在滤布上,收集流出的液体。当固体颗粒直径较小(10微米左右)时,因滤布孔径太大,上述两种办法则难以奏效。现在多采用沉降式离心机来除去固形物。瑞典ALFA-LAVAL公司生产的碟片式离心机就属这类离心设备。待澄清的液体进入这种离心机后,随着转鼓以每分种5000—7000转的高速旋转,惯性离心力的作用下,液体顺着机内碟片,边转边上升,并从?部溢出,而颗粒物质因比重较大,则不能进入碟片,被存留在转鼓的直径最大处》当清液停止流出时可将固形物自动排出。这种离心机有梠当于400米2的过滤面积,处理发酵液的能力非常强,5吨液体仅用一个小时就可处理完毕,可谓得心应手,但遗德的是许多发酵液呈粘稠悬浮液,无论是板框压滤机还是各种离心机,都无法除去其内固形物质,必须另想办法重.辟蹊径。

对一些发酵粗制品,不需提纯。如某些粗酶制剂,只要将全部发酵液内水分除去,变成固体就可以了。由液体制成固体产品的传统方法,不外是蒸发,浓缩、结晶、过滤和干燥几个步骤。利用目前许多工业普遍使用的喷雾干燥方法,可以将这些工序统统免去,直接制成千燥的粉末或颗粒。这是采用雾化器将液体物料分散为雾滴,并用热空干燥雾滴而获得产品的一种方法。食品工业中应用喷雾千燥法,将事先经过浓缩的牛奶制成奶粉,就是很好的例子。微生物发酵生产的酶与牛奶类似,同厲热钕性物质,最忌过热,否则将使酶活性损失。如碱性蛋白酶在60X3持续4分钟后,酶活力仅残存70%,因此用普通加热与浓缩脱水方法是不合适的。

在喷雾千燥处理中,待喷物质须先用泵打入雾化器内,使液体分散为微细的雾滴,其平均直径约20?60微米,因具有很大的表面积,当与热空气接触时,雾滴迅速汽化而干燥。雾化的方法中,气流式喷嘴是采用压缩空气将液体分裂为雾?压力式喷嘴是用高压泵使高压液体高速喷出分散为细雾;旋转式雾化器则使料液在高速转盘中受离心力作用,从盘中甩出而雾化。雾滴在干燥塔(室)内飘然而下,干燥的热空气与它先并行后逆行,或先逆行后并行,将热量传递给雾滴,使其的水分汽化,通过界面进入空气,雾滴则遂渐干燥而变为固体粉末或小颗粒,它们沿着干燥塔的锥体塱滑行至底成为产品。根据料液的浓度、所需的温度和干燥的时间就能计算出千燥塔的尺寸大小。这种干燥方法最大的特点是:实际千燥时间很短,通常仅10?20秒即可。因此,对热敏性物质的损失不会太大。例如a-淀粉酶和蛋白酶使用喷雾千燥法制成酶制剂时,进口温度是14℃,出口温度72℃)时,得到的产品其酶活力损失仅20%左右,收得率基本接近于其它方法。喷雾干燥方法尽管存在消耗能量太大的缺点,但对于那些不需分离精制的较粗发酵产品的制造,仍不失为一个减少设备,简化工序的好方法。

在抗菌素发酵中,经常在发酵液离心去掉固形物以后采用萃取的方法来得到产品。原理是利用产物在两种溶剂中的溶解度差。例如青霉素在醋酸戊酯中的溶解度比在水中溶解度大得多,当PH2.5时,溶解在醋酸戊酯中的青霉素是溶解在水中的44.7倍。因此萃取时,选用醋酸戊酯加在预处理后的发酵液中,因有机溶剂(醋酸戊酯J与水又不相互溶,类似油与水在一起要分层一样,则能把青霉素从发酵液中转移到醋酸戊酯中去。一般来说溶剂的沸点都比水低很多,所以溶解有产物的溶剂可以在相对低的温度下浓缩,既不影响产品的质量又节省了能源,同时还容易地回收溶剂。浓缩液在一定条件下结晶,就可得到非常纯净的产品

若能在发酵液中单独挑选出人们所需要的物质,该有多好啊!离子交换技术能实现这种想法,并已在生产上大规模使用。离子交换树脂是由髙分子化合物(如聚苯乙烯)和交联剂(如二乙烯苯)组成的髙分子共聚体。它是一神具有特殊的、疏松的、多孔的或象海绵状网状分子结构物质。分子结构可以分为两部分,一是不能移动的基团,是分子量大的不溶性有机物为树脂的骨架;其二是具有交换作用的活性基团(图11)?根据解离基团的解离度大小又可分为强弱两子交换。

如何选择离子交换树脂,除了考虑被提取物本身所带的电荷及其电性强弱、分子大小和对酸碱的稳定性之外,还要注意环境中存在杂质的性质。一般原则是强碱性物质要选用弱酸性树脂,弱碱性物质要选用强酸性树脂。这样才容吸附,洗脱也不困难。作用的原理是溶液中被提取物的离子扩散到树脂表面,并进人树脂内部的活性基团上,其阳(阴)离子与树脂内活性基团的阳(阴)离子交换位置,然后树脂中被交换出的离子由树脂内部到表面,再扩散到溶液中去。当把树脂装入一个圆简内时,树脂形成一个离子交换柱,要分离的物质从上面加入后,被树脂吸附,流出的液体就不再含有该物质了。小小的树脂颗粒就象许多只手,准确而有力地抓住了我们要提取的物质,对其它杂质则“放任自流”,不予理睬。

在谷氨酸发酵结束后,离心去除菌体,接着便可使用732强酸性阳离子交换树脂来提取谷氨酸。即谷氨酸阳离子与树脂上的氢离子进行交换,实际上就是发酵液所含的谷氨酸被选择性地挑了出来。这时经过离子交换柱流出的液体,因含有H+而酸性越来越强。至于谷氨酸的含量、用树脂的数、交换时间和温度等,必须经过计算和试验才能确定。待全部谷氨酸吸附完毕,就开始用氢氧化钠溶液中的钠离子,将谷氨酸离子解脱下来,这称为洗脱。其化学反应式如:R—SOlHlNI^℃OOH十a0H—R-S℃^Na++]^以1^(:0011+&0适当掌握洗脱时间就可以得到很純的谷氨酸。使用过的树脂并不弃去不要,而是加入盐酸溶液使之得到再生。其离子的交换、洗脱化学反应式如:

R-SO;Na+十H℃1——S03H++Nal树脂的再生是每一种离子交换技术的三个主要步骤之一。通过离子交蟓处理后,产物浓度大大提高,可以进一步浓缩、结晶而得到产离子交换树脂除用于物质的提取外,近年来还用于酶和菌体的固定化。一种能催化葡萄糖转化为果糖的葡萄糖异构酶,通常以液体形式应用,酶与菌体只能使用一次。如果将它们固定在某种载体上就可以延长寿命而多次使用了。一些离子交换树脂在制造时加入致孔剂,使得树脂除有一般微孔之外,还形成一些“大孔”,它就可以成为微生物菌体或酶蛋白的栖居场所。一般菌体的固定化是与离子交换树脂直接接触而被吸附。酶的固定化则是酶与树脂的离子吸附或共价结合。前者是因酶本身蛋白质具有两性多价电解质的特性,其带电基团与离子交换树脂的离子性基团进行静电相吸;后者是树脂上的离子性官能团经活化后与酶的某些基团通共价键进行连结。本来是液体的酶固定在离子交换树脂上后,就变成了固体形式。葡萄糖液流经固定在离子交换树脂上的异构IS时,就可以变成更加甜美的果糖。当然树脂的骨架、孔径的大小、吸附或结合的条件,都对酶的固定发生影晌。当使用一定时间后,带有酶的离子交换树脂还可以再生,再生后的树脂又可以重新与酶结合起来。有人以D-290树脂制成的葡萄糖异构酶装柱,在60°℃溶液中,仔细调节葡萄糖液流速,可以得到40%的果糖,使用35天后酶活性仅损失一半。除这个酶之外,象RNA酶、溶菌酶、葡萄糖氧化酶、乳糖酶、氨基酰化酶等酶类亦可用离子交换树脂进行固定。固定化菌体技术更加复杂和多样,将会给发酵过程带来革命性的变化。



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